Curso de inmuno-oncología del CNIO

Inmuno-Oncología 1: ¿Cómo evaden las células tumorales la respuesta inmune?

(Notas tomadas de la clase de Manuel Fresno)

Ya desde 1909 Ehrlich postuló que una de las funciones del sistema inmune era la destrucción de cánceres que se formaban (de-novo). A esta función se le acuñó el nombre de IMMUNE-SURVEILLANCE. Para que estos tumores se desarrollen, se necesita que el sistema inmune falle, y les permita crecer. Como apoyo a esta hipótesis los investigadores encontraron que algunos tumores exhibían infiltrados inmunológicos, hiperplasia de ganglios regionales, y el incremento de algunas neoplasias en pacientes con inmunosupresión. Ya en modelos preclínicos muy elegantes se logró establecer que los linfocitos CD8 son los encargados de eliminar los tumores.

Los linfocitos antitumorales, como todos los otros, montan respuesta inmune contra unos antígenos. ¿Cuáles son los antígenos tumorales que van a desencadenar la respuesta inmune? Los antígenos tumorales son una bolsa heterogénea de elementos que incluyen productos de genes mutados por el tumor, genes disregulados con expresión aberrante (incluyendo la extraña variante de spbre-.expresión de proteínas que causa exceso de epítopos), y productos asociados a virus oncogénicos. Los antígenos tumorales se clasifican en 3 grupos: TAA (o antígenos asociados a tumores), TSA (o antígenos específicos de tumores) y TSA-Clonales (o antígenos específicos de un tumor en UN individuo). Algunos de esos antígenos tumorales son sustancias normales durante el desarrollo embriológico que son expresados por las células tumorales, y que el sistema inmunológico no reconoce como propios (ie, MAGE).

El mecanismo de tumorogénesis puede tener implicaciones terapéuticas. Por ejemplo, si el tumor se originó por un virus oncológico, dando origen a varios tipos de tumores, la respuesta inmunológica contra uno de ellos puede tener eficacia contra todos los demás. Ello significa que los antígenos asociados a tumores reconocidos por los CD8 son comunes a varias estirpes tumorales. Por otro lado, si el tumor es causado por carcinógeno químico que da origen a varios tipos distintos de tumores, la respuesta inmune antitumoral va a circunscribirse a uno de los tipos de tumores, implicando diferentes antígenos tumorales para cada una de las neoplasias inducidas.

¿Cuáles son los mecanismos del immune-surveillance?

Como ya lo dijimos, los linfocitos CD8-citotóxicos son críticos para este mecanismo; sin embargo, no están solos en esta función pues los linfocitos NK, los macrófagos y células dendríticas son también importantes. La importancia del sistema inmunológico humoral es menor ya que la citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) no es tan crítica para el control in-vivo (aunque ha sido utilizada con éxito en algunas plataformas de tratamiento clínico como Rituximab anti-CD20 y trastuzumab anti-HER2).

La vía canónica de activación de los linfocitos T se describe a continuación, en secuncia.

1.       Primero los antígenos tumorales son captados y procesados por células presentadoras de antígenos (APC) como las células dendríticas (y otras células casi todas ellas de estirpe macrofágo). Los antígenos seleccionados por estas células son presentados en la membrana celular asociados a sus respectivos complejos mayores de histocompatiblidad (MHC) clase I y clase II.

2.       Los MHC clase II con el antígeno tumoral presentado es reconocido por el receptor de células T (TCR) de los linfocitos T4 (ayudadores), que se activan con la ayuda de moléculas co-estimuladoras (ie, CD28-B7). Estos linfocitos ayudadores liberan citokinas que van a estimular más  a las APC, así como a los linfocitos T8.

3.       Los MHC clase I con su antígeno tumoral presentado es reconocido por el TCR de los linfocitos T8 (citotóxicos). Como todos los linfocitos T, la unión MHC-TCR de los T8 es necesaria pero NO suficiente para activarlos. Para obtener la activación se necesita la interacción de las moléculas co-estimuladoras como CD28-B7. Hasta aquí todo ha sucedido en los órganos linfoides (ganglios linfáticos, bazo, etc).

4.    Una vez activados los linfocitos T8 salen a la circulación. Cando se encuentran el tumor que expresa el antígeno específico dirigen su acción antitumoral siempre y cuando se establezcan además interacciones intercelulares por intermedio de los sistemas LFA-1/ICAM (Se requiere de interacción MHC clase I – TCR, así como co-estimulación).

5.       La citotoxicidad es mediada por la liberación de gránulos que contienen PERFORINA una proteína que es capaz de crear LETHAL HOLES en las células tumorales. Además de la perforina, los linfocitos T8 citotóxicos liberan GRANZYMA, FAS-L y citokinas. La perforina causa daños osmóticos y de potencial de membrana que hacen que las células no sean viables. La Granzyma y el Fas-L inducen apoptosis por mecanismos complementarios. El resultado final es la destrucción de la célula tumoral.

Si bien es cierto que los linfocitos T8 son los efectores antitumorales más importantes, las células NK también pueden ejercer funciones antitumorales pues tienen la misma maquinaria destructiva de los linfocitos T8 que es activada en forma menos específica, pues selecciona para la destrucción aquellas células que estén ESTRESADAS (reconocen ROS, infecciones virales, etc). Todos estos detonantes de activación de NK se denominan Killer-Activator Receptors.

Los macrófagos también tienen una función en la destrucción de células tumorales pues también fagocitas células estresadas, inducen factores como el TNF, así como ADCC.

Si estos mecanismos funcionaran siempre, no habría cáncer. ¿Cómo evaden las células tumorales la respuesta inmune?

Lo pueden hacer de todas las formas que usted puede imaginar: Limitando los antígenos asociados a tumores, no expresando MHC-I, ausencia de moléculas co-estimuladoras, secretar los antígenos tumorales a la circulación para que los linfocitos T estén ocupados donde no están las células tumorales. Las células tumorales, además, desarrollan mecanismos activos de inmunosupresión como la liberación de FAS-L, secreción de proteínas inmunosupresoras (PGE2 o TGFBeta), inducción de T-regs así como las células mieloides supresoras. La presión evolutiva de las células tumorales hace que se genere una INMUNOEDICIÓN en donde las células que sobreviven son aquellas que tienen un comportamiento más agresivo y son menos inmunogénicas.

Un mecanismo particularmente importante de obliteración de la respuesta inmune antitumoral consiste en la activación del sistema PD1-PD-L1, que se explicará con más detalle en la siguiente clase. Basta con decir que la interacción de los linfocitos T8 con la célula tumoral hace que el linfocito T activado secrete interferón. El interferón a su vez estimula la expresión de PD-L1 en la célula tumoral. De esta forma el PD1 expresado en la membrana celular del linfocito T8 interactúa con el PD-L1 inducido abrogando la actividad antitumoral del linfocito T8.

Inmuno-oncología 2: Melanoma

(Resumen de la clase de Antoni Ribas)

Desde hace varias décadas se sabe que algunos tumores responden a terapias inmunológicas. Específicamente, los melanomas, cánceres renales han sido considerados candidatos a tratamientos con Interleucina-2 o con interferón, con resultados modestos, pero con algunas curaciones en enfermedad avanzada.

Otras estrategias para activar el sistema inmune como vacunas antitumorales han decepcionado, pese a que hay más de 900 ensayos clínicos que las han investigado.

Otra estrategia terapéutica potencial es la manipulación de los reguladores de linfocitos como el OX40, CD137, etc. Sin embargo, todavía no hay resultados palpables de esta estrategia.

La explotación clínica de los reguladores inmunológicos negativos como el sistema CTLA4 y PD1-PD-L1 han demostrado eficacia en varios tipos de neoplasias (melanoma, carcinoma renal, carcinoma de pulmón, entre otros). De hecho, están revolucionando la forma como ejercemos la oncología.  Todas las estrategias mencionadas hasta aquí corresponden a inmunoterapia ACTIVA.

La inmunoterapia ADOPTIVA consiste en la CONSTRUCCIÓN de linfocitos antitumorales por medio de ingeniosos mecanismos como la expansión ex-vivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TiL) o la incorporación por bioingeniería de TCR anti-tumorales en linfocitos del paciente o la formación de CAR (receptores de células T quiméricas que incluyen la fase variable que responde al antígeno tumoral).

El Dr. Ribas vuelve a explicar los mecanismos de activación de la célula T8, enfatizando la importancia del reconocimiento del MHC-I con antígeno y el TCR (señal 1), así como la interacción del CD28 linfocitario con la molécula co-estimuladora B7 en la APC (también conocida como CD80/86)(Señal 2). Estas interacciones críticas van a dar origen a un linfocito T activado (licenciado). Esta fase es regulada por el CTLA4 linfocitario que desplaza el CD28 por su afinidad por el B7 de las APC, silenciando la activación del linfocito T8. Diríamos que el sistema CTLA4-B7 bloquea la señal 2 de activación de los linfocitos T8.

El Ipilimumab es un anticuerpo contra el CTLA4 que causa respuesta en aproximadamente 10% de los pacientes con melanoma avanzado. Las respuestas, sin embargo, tienden a ser duraderas. Se considera que el Ipilimumab desbloquea la señal 2, permitiendo a los linfocitos T8 realizar su trabajo antitumoral. Sólo responden 10% porque, se postula, que sólo 10% de los pacientes tienen linfocitos T que reconocen antígenos tumorales lo suficientemente relevantes para controlar la enfermedad.

En estudios preclínicos se logró establecer que la actividad proliferativa linfoide se aumenta en forma extraordinaria con los anti-CTLA4. De hecho, mediante experimentos elegantes se logró establecer que los clones previamente expandidos NO son los que se expanden cuando se utilizan anti-CTLA4. Los que se expanden son los clones NO previamente expandidos. Esto significa que se expande la DIVERSIDAD de linfocitos antitumorales.

Como mencionábamos, el 10% de los pacientes con melanoma maligno responden a tratamiento anti CTLA4. También sabemos que aproximadamente 50% de estos pacientes tiene infiltración linfocitaria en el tumor. ¿Qué pasa con los otros?

Aquí llega el momento de sistema PD1-PD-L1. Como vimos en la clase pasada la interacción de los linfocitos T8 con las células tumorales por intermedio del TCR/antígeno con el MHC clase I (así como la señal 2, siempre necesaria) induce activación de los linfocitos T8. Estos liberan interferón que causan la expresión de PD-L1 en las células tumorales. La actividad citotóxica de los linfocitos T es abrogada cuando su PD1 se une al PD-L1. Así que la expresión de PD-L1 es reactiva, y de alguna manera podría predecir actividad clínica con la modulación de esta vía.

En la clínica, los inhibidores de PD1 como el Nivolumab y el Pembrolizumab han demostrado actividad contra el Melanoma, Carcinoma de células renales y carcinoma broncogénico (y la lista va aumentando, ver ECC2015 en Viena). Los estudios con anti PD1 en melanoma tuvieron 2/3 de respuesta, con 1/3 de los pacientes obteniendo respuestas parciales por criterio RECIST. Los pacientes que respondían, la respuesta es duradera en 88% (seguimiento de 6 a 18 meses). Incidentalmente, la toxicidad es mínima – sólo un 12% tienen toxicidad grado ¾ (astenia, prurito y exantema), y aproximadamente 1% tienen toxicidades autoinmunes más serias.

Una observación interesante, es que los pacientes con melanoma que responden a terapia anti PD1 frecuentemente exhiben despigmentación de la piel (similar al vitíligo), control de tumores basocelulares y queratosis actínica. Todo esto indica que los linfocitos T8 des-reprimidos tienen clara actividad contra las células cutáneas.

El grupo del Dr. Ribas analizó qué pasa con los linfocitos en los tumores de pacientes que respondían a anti PD1. Se encontraron que el infiltrado de linfocitos EN el tumor era mayor (con tinciones de S100 para melanoma y CD8 para linfocitos). Algunos pacientes no tenían linfocitos infiltrando los tumores al inicio del tratamiento, pero con el tratamiento fueron aumentándolos (configurando lo que llamamos pseudoprogresión, pues esta acumulación celular puede ser interpretada con aumento de masa tumoral por las imágenes convencionales).

El mecanismo de acción último del PD1 activado es la activación de la ser/tre proteasa SHIP que inhibe la cascada de señalización del TCR. Debloqueando la actividad de la TCR se produce expansión clonal con incremento de los CD8 (y del Ki67) como se ha observado en modelos preclínicois.

¿Cómo sabemos que el interferón es el que induce el PD-L1 en las células tumorales?

Se analizó la expresión de STAT1 fosforilada (parte de la STP del interferón) en las células tumorales. Se encontró que la fosfo-STAT1 se aumentaba cuando había respuesta al tratamiento anti PD1. También se estableció que la secreción Granzima ocurría DESPUÉS de, y no antes de, la administración del anti-PD1.

Se concluye que la activación PD1-PD-L1 es reactiva a la presencia de linfocitos T8 selectivos contra el tumor, y que debe haber CO-LOCALIZACIÓN espacial de linfocitos/tumor.

Según este modelo, se predice respuesta a anti-PD1 en pacientes cuyos tumores tengan alta infiltración CD8+ en el margen tumoral. En una colaboración transatlántica, el grupo del Dr. Ribas en UCLA buscó predecir en forma ciega la probabilidad de respuesta de un grupo de pacientes del I. Gustav Roussy de Paris basado en las características patológicas del tumor ANTES de la iniciación del tratamiento anti-PD1. Se analizó la presencia de linfocitos CD8+ en el margen de la biopsia. Sólo se equivocó en forma importante en 1/16 pacientes.

Nos persuade el Dr. Ribas que si un melanoma tiene gran cantidad de linfocitos T8 infiltrando la periferia del tumor, sólo necesitamos desbloquear su activación con el anti-PD1 para obtener una buena respuesta.

¿Qué hacer con aquellos pacientes que NO tienen linfocitos en el tumor?

Aquí entra la terapia celular inmune adoptiva. Se puede resumir en: si no lo tiene, constrúyalos. Una forma puede ser la expansión de TiLs (aunque, se me ocurre a mí, si tienen TiLs lo único que se necesita es bloquear el PD1 para que esos linfocitos ejerzan su actividad antitumoral…).

Otra forma es expandir un linfocito T8 que haya sido exitoso en el control del melanoma de algún paciente (ie, que responda eficaz al antígeno melanocítico como el MART-1), transfectar su TCR específico a los linfocitos T del paciente que necesita tratamiento (utilizando como vector un retrovirus). Posteriormente expandir el clon del paciente con su receptor quimérico, y re-infundirlo después de darle quimioterapia que le dé “espacio” a los linfocitos para que crezcan.

En la fase inmunológica de la conferencia, el Dr. Ribas esencialmente nos invita a usar anti PD1 en pacientes con linfocitos T8 listos pero inactivos, o a generar linfocitos T8 listos cuando estos no existen.

¿Cómo se integra la terapia molecular dirigida con la inmunoterapia en melanoma?

Sabemos que aproximadamente la mitad de los ricos con melanoma tienen mutación del BRAF que los hacen susceptibles a terapia anti-BRAF. Sabemos que la inactivación del BRAF puede causar activación paradójica del CRAF en los linfocitos, y que ello posiblemente explica la alta hepatotoxicidad observada cuando se combinó terapia anti-BRAF con Ipilimumab. Con la inhibición adicional del MEK, se considera que esta activación paradójica del CRAF no generará tanto problema permitiendo la incorporación exitosa de las 2 estrategias terapéuticas (dirigida / inmunoterapia) en forma simultánea.

Inmuno-Oncología 3: Cáncer del pulmón – visión del patólogo

(Resumen del profesor Wistuba).

La clase versó sobre aspectos generales de cáncer del pulmón que no me aportó demasiados conocimientos nuevos sobre los aspectos inmunológicos. Creo que parte del problema estribó en que el curso fue diseñado antes del 2015, y todo ha cambiado sustancialmente entre el momento en que se impartió la clase y el día de hoy. Lo que fue más interesante para mí fue el algoritmo de manejo de las pequeñas muestras que son tan comunes en ese 80% de pacientes que presentan con cáncer de pulmón metastásico donde el espécimen tumoral disponible es pequeño. Lo que recomienda el Dr. Wistuba es utilizar un corte para histología convencional, y tratar de dirimir si es un SCLC, Adeno-NSCLC o un SCC-NSCLC. Si en el corte no es claro, se recomienda practicar IHC con TTF1, P63 y p40  para diferenciar adeno (TTF1) de SCC. Todo lo anterior por las implicaciones obvias para nosotros del tratamiento de uno y otro. Para los adeno-NSCLC se debe realizar procesamiento en PARALELO para las mutaciones más importantes como EGFR, ALK/EML4 y ROS1. El EGFR se realiza por métodos moleculares, y el ALK se puede realizar por FISH o IHC. También con implicaciones obvias para terapia dirigida en pacientes con mutación del EGFR, ROS1, translocación ALK/EML4. Ahora con el advenimiento de NGS se pueden interrogar muchos genes en forma simultánea (no disponible para nosotros en Colombia). Una cosa interesante que mencionó el Dr. Wistuba es que la heterogeneidad intratumoral que se informó en publicaciones importantes NO es por formación de nuevos clones que aparecen durante el tratamiento. Se trata más bien del crecimiento selectivo de clones que eran identificables desde el INICIO de la enfermedad, pero que constituían una minoría de la población tumoral. Esto sólo se pudo establecer al incrementar la PROFUNDIDAD de la interrogación génica (si una misma base es interrogada 800 veces, es más fácil encontrar todos los subclones que conforman el tumor).

Dos perlas interesantes que nos mencionó el Dr. Wistuba, ya sobre los aspectos inmunológicos es que la expresión de PD-L1 no sólo se circunscribe a la célula tumoral, sino también a las células estromales (dendríticas), así como los linfocitos T. Que cuando no hay expresión de PD-L1 tiende a haber menor respuesta antitumoral con la terapia anti PD1. Sin embargo, no está claramente establecida la expresión de PD-L1 como un marcador confiable de respuesta.

Los tumores que tienen mutación del p53 tienden a tener mayor respuesta inflamatoria. Será que la mutación de p53 se convertirá en biomarcador para respuesta antitumoral de agentes inmunológicos?

Finalmente, se enfatiza la importancia de realizar biopsia en cada momento de la enfermedad.

Terminó el curso de inmonología oncológica del CNIO

En mi opinión, una excelente oportunidad para aprender sobre este tema. Los tres docentes son muy claros y conocedores profundos de sus temas.