Regulación del ciclo celular

1. Saludos, les habla el Dr. Mauricio Lema Medina. Durante los siguientes minutos voy a describirles algunos aspectos fundamentales sobre el control del ciclo celular. Como referencia fundamental, utilicé el capítulo del mismo título del libro de Mendelsohn sobre Bases Moleculares del Cáncer, citado en la diapositiva. Este documento es un complemento al curso de oncología para estudiantes de la Universidad CES, Medellín, impartido en 01 y 02 de 2009.
2. La función del control del ciclo celular es asegurar la duplicación del material genético celular, y la división de este material genético de una manera tal que cada célula hija contenga una copia al momento de la división celular, o mitosis (Fase M). En la fase S del ciclo se replica – esto es – duplica el DNA. Las fases G1 y G2 de relativa quiescencia antes de la fase S y M, respectivamente, son preparatorias para los eventos que ocurren en estas últimas fases. El objetivo de este documento es describir los reguladores mayores del control del ciclo celular.
La progresión del ciclo celular es regulada por una familia de kinasas de proteinas denominadas kinasas dependientes de ciclinas o CDKs. Las CDKs son inactivas a menos que establezcan complejos con otras proteinas denominadas ciclinas. La actividad kinasa de las CDKs se establece en el momento en que las ciclinas se les unen.
El complejo CDK4, 6 con las ciclinas D son importantes para estimular la progresión del ciclo celular en la fase G1. El complejo CDK4/6 con Ciclina D es particularmente interesante pues son las que responden a estímulos mitogénicos externos, como factores de crecimiento, etc.
Durante la preparación, así como en la misma fase S, la Ciclina E con CDK2, seguida por la Ciclina A con la misma CDK2 son esenciales para la progresión del ciclo hacia G2.
Durante la fase S se empiezan a sintetizar Ciclina B, que se va acumulando primero en el citoplasma donde es inactivas, y posteriormente – cuando se acerca la mitosis – en el núcleo celular. Unida a la CDK1, la Ciclina B es importante para el proceso de división celular.
Todo este proceso es altamente regulado. En la imagen se ilustran dos familias que interfieren con el ciclo celular en la fase susceptible de control exógeno, esto es en G1. Las proteinas de la familia INK4, y Cip/Kip son importantes antagonistas de las CDK4/6 y CDK2, respectivamente. Estos conceptos se ahondarán en los siguientes minutos.
3. Control del ciclo celular en G1, hasta el punto de Restricción.
El ciclo celular consta de varias fases, como ustedes bien saben. En la fase G1 la célula se prepara para la fase replicativa – o fase S. En la fase S se replica el DNA paso esencial para la eventual división celular en sus dos hijas. En esta diapositiva se ilustran los puntos más salientes de la progresión de G1 hasta después del punto de Restricción, que se define como el momento en que la célula se vuelve independiente de los mitógenos exógenos (factores de crecimiento en la diapositiva).
1. Los factores de crecimiento ejercen su acción estimulando la transcripción de la diferentes Ciclinas D (D1, D2 o D3, según el órgano). Las ciclina D se une a las kinasas dependientes de ciclina 4 o 6 (CDK4 o 6). Para simplificar la diapositiva, no se ilustra la CDK6.
2. Las CDK4 (o 6) son activadas cuando se unen a la ciclina D. El sustrato fundamental de esta CDK son las proteinas de la familia Retinoblastoma (Rb en la diapositiva). Otros miembros de este grupo incluyen el p107 y el p130 (no ilustrados en la diapositiva para simplificar la diapositiva). En condiciones inactivas – esto es hipofosforilado – las proteinas retinoblastoma forman complejos con factores de transcripción E2F, manteniéndolos inactivos. Cuando las proteinas Retinoblastoma (así como p107 y p130) son fosforilados, se libera el E2F permitiendo su interacción con el DNA.
3. El E2F se liga al DNA junto con otros factores como el DP1 no ilustrado en la gráfica, y estimula la transcripción de múltiples genes. Críticos para la progresión del ciclo celular son la transcripción de las ciclinas E y A. Hasta este momento, la progresión del ciclo celular depende de la exposición continua a factores de crecimiento o mitógenos.
4. Después de cierto momento, se genera una cantidad crítica de Ciclina E, que activa su CDK – la CDK2 – que se encarga de la fosforilación activante de las proteinas de la familia retinoblastoma, perpetuando la liberación del E2F, estableciendo un círculo de retroalimentación positivo, ya independiente de mitógenos, que progresa inexorablemente a las fases siguientes de ciclo celular. Como ya se mencionó, el punto R es el momento en que la célula está comprometida a pasar a la fase S aún en ausencia de estímulos mitógenos. Para la fase final de G1, la célula está lista para iniciar la fase S al ensamblar los componentes replicación de DNA en la cromatina en los llamados orígenes de la replicación (no ilustrado).
4. El complejo CDK4 (y 6) y la Ciclina D tienen funciones no dependientes de su actividad kinasa. Tal vez la más importante es la de hacer complejo con las p27 (y p21) que son inhibidores de las CDKs 1, 2, y 3. De esta manera evitan la acción de estas moléculas deteniendo la progresión del ciclo celular. La fosforilación del p27 por la CDK2 la marca para la destrucción por el sistema proteasoma.
Existen inhibidores de las CDK4 y CDK6 denominados ink4, a los que pertenecen el p16, p15, p18 y p19.
5. En esta imagen se integran los conceptos ilustrados en las 2 diapositivas anteriores.
6. El daño en el DNA activa el p53 que detiene la progresión del ciclo celular incrementando la transcripción del inhibidor de kinasa dependiente de ciclina p21/Cip1. La p21 inactiva las CDK1, 2, y 3, pero el efecto principal es ejercido sobre la CDK2, inhibiendo la progresión del ciclo celular después del punto de restricción, causando “cell-cycle arrest”. El p53 también ejerce otras acciones celulares que incluyen inducir apoptosis (no ilustrado).
7. Esta es la estructura tridimensional del complejo p27/CDK2/Ciclina A. El p27 inhibe la actividad del complejo CDK/Ciclina. El p21 ejerce su acción en forma similar. La expresión del p27 es razonablemente estable durante el ciclo celular. Cuando hay señales de proliferación celular, el p27 es fosforilado. El p27 fosforilado es ubiquinado y destruido por el sistema proteasoma.
El p21, en cambio, es inducido por el p53 como respuesta a daño en el DNA, como se explicó en la gráfica anterior.
8. Los otros inhibidores de las CDK son los específicos para las CDK4 y CDK6. Estos se denominan ink4s – inhibidores de las CDK4. Estos incluyen los p16, p15, p18 y p19. En la figura se observa la estructura tridimensional del complejo p19, in Ink4, y el CDK6.
9. Regulación de la replicación de DNA – Fase S
Durante la fase G1 del ciclo celular se prepara la célula para la replicación celular, o fase S en la que el DNA es sintetizado.
Para iniciar la replicación, se deben “Licenciar” los cromosomas en los origens (los origens son las posiciones en la cromatina donde la DNA polimerasa inicia la replicación).
Para obtener el “licenciamiento” se debe configurar el pre-RC (o pre-replication complex). En la diapositiva se ilustra el proceso de formación del pre-RC, e inicio de la fase S.
Durante toda la duración del ciclo celular, los ORC (Origin Replication Complex) están constitutivamente unidos a la cromatina en ciertos sitios. Los ORC están inactivos durante la mayor parte del ciclo celular.
La formación del Pre-RC requiere de la unión de la Cdc6 al ORC.
El Cdc6 sirve como ancla para el reclutamiento del MCMs y Cdt1. Los MCM2-7 (minochromosome maintenance proteins), son complejos heterohexaméricos compuestos por 6 proteinas diferentes, pero relacionados denominados MCM2 a MCM7. Se considera que el complejo MCM2-7 es la helicasa replicativa. La función de la Cdt1 es facilitar la unión del complejo MCM2-7 al ORC por intermedio de la Cdc6.
Se produce estabilización del complejo MCM2-7 al ORC por medio de varias fosforilaciones críticas a cargo de la Cdc6. La Cdc6 también fosforila la Cdt1, que termina desaociándose del ORC, y es destruida por el sistema proteasoma luego de ser ubiquinada. La CDK2 fosforila varios sustratos del ORC que los estimula. No todos los sustratos fosforilados por la CDK2 están elucidadas, pero incluyen MCM2, MCM4 y ORC1. Como otras CDK, la CDK2 depende de la unión con las ciclina E y la ciclina A. Otra kinasa similar estructuralmente a las CDK, la Cdc7/DBF4 también juega un papel en la fosforilación activante de varios sustratos del Pre-RC. La presencia de los complejos CDK2/Ciclina E y CDK2/Ciclino A son esenciales para la progresión durante esta fase del ciclo celular.
Reclutamiento del MCM10 que, a su vez, recluta la Cdc45. Esta última es la encargada de reclutar la DNA polimerasa alpha y la primasa (no ilustrada). El Pre-RC está listo para iniciar la replicación.
Se inicia la fase S, con la replicación del DNA. Para evitar la re-replicación, la CDK2 fosforila la Cdt1, marcándola para la destrucción por proteasoma (no ilustrado).
Todo este proceso ocurre en la fase final de G1, después del punto de Restricción, y culmina con el inicio de la fase S.
10. Eventos críticos que indican el paso a la mitosis
La progresión del ciclo celular hacia la mitosis depende de la Ciclina B y la CDK1. Durante la fase S se inicia la transcripción de la Ciclina B, que es mantenida en forma inactiva por una fosforilación inactivante por las proteinas Wee1 y Myt1. Durante este fase, la Ciclina B está localizada predominantemente en el citoplasma, otra razón por la que es inactiva.
A medida que el ciclo celular va avanzando, se sintetizan las proteinas de la familia CDC25 que tienen la capacidad de remover la fosforilación inactivante sobre la ciclina B y, además, proceden con fosforilación activante sobre la ciclina B. Esta reacción empieza a ocurrir en el núcleo celular, haciendo que la localización de la ciclina B empiece a aumentar donde es activa.
La combinación CDK1/Ciclina B activa causa un ciclo de retroalimentación positiva inactivando el Wee1 por medio de fosforilación, con marcación para la destrucción por el sistema de proteasoma, así como la fosforilación activante de las moléculas de la familia CDC25.
Este efecto es amplificado, a su vez, por la PLK1 (polo-like kinase 1) que confiere una fosforilación inactivante de la Wee1; y fosforilaciones activantes de la CDC25C, y Ciclina B, en el núcleo.
La progresión hacia la profase, metafase y anafase se ejecuta en forma estereotipada (no se ilustra).
11. El Checkpoint mitótico
El primer objetivo de la mitosis es asegurar que cada célula hija reciba un complemento cromosomal después de la división celular.
La célula sólo se divide cuando los cromosomas se unen a los microtúbulos del huso mitótico.
El checkpoint mitótico evalúa si los kinetocoros están adecuadamente unidos.
El complejo encargado de esta función es el denominado Mitotic Checkpoint Complex o MCC. Este está compuesto de varias proteinas como lo ilustra la diapositiva. Incluyen las CENP-E o proteina asociada a centrómero E, y las mitotic arrest deficiency proteins 1 y 2, o Mad por sus siglas en inglés.
Los kinetocoros no unidos, causan una fosforilación inactivante de las Mad 1 y Mad 2. Estas, a su vez, inhiben la actividad de la Anaphase-promoting complex / cyclosome, o APC/C, evitando la progresión hacia la anafase.
La unión adecuada de los kinetocoros a las estructuras mitóticas, libera la inhibición del APC/C y se procede con la anafase y telofase, fases finales de la división celular.
12. El entendimiento de los procesos involucrados con la mitosis es un poco menos completo que el que se tiene sobre la fase G1, pero está avanzando rápidamente. En la diapositiva se ve una hermosa ilustración de las diferentes subfases de la mitosis.
13. La importancia práctica del entendimiento de estos procesos en oncología es grande. Como se ilustra en la tabla, muchas de las proteinas mencionadas están involucrados en la génesis o mantenimiento de neoplasias malignas. Típicamente, los inhibidores de crecimiento funcionan como genes supresores de tumores. Cuando hay mutación inactivante de estos, se aumenta la proliferación celular y el potencial oncológico. El p53, Rb, p16 y otros INK4, p27 y otros Cip/Kip, PLK1 y el APC/C pertenecen a este grupo. En especial, la mutación inactivante del p53 es la anormalidad genética más común en las neoplasias malignas. Las sobre-expresión de ciclinas y CDKs estimulan directamente la proliferación celular, y funcionan como oncogenes.
Les habló Mauricio Lema Medina, y este documento fue preparado en 01/2009.